СПЕЦИФИЧЕСКИЕ ДЕФЕКТЫ ДНК: НОВЫЙ КЛАСС МАРКЕРОВ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА
А.В. Лихтенштейн, О.И. Сердюк, И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, В.П. Шелепов
ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Теоретические предпосылки. Один из практических результатов прогресса, достигнутого в последние годы в исследовании рака, - идентификация нового класса опухолевых маркеров, а именно генетических (или ДНК) маркеров. Имеются в виду последовательности протоонкогенов, генов-супрессоров и других функционально значимых генов, специфические повреждения которых являются первопричиной и движущей силой канцерогенеза. Таким образом, измененные (дефектные) последовательности ДНК в случае их обнаружения в тех или иных биологических средах организма, могут служить сигналом онкологического неблагополучия.
Практические возможности. В зависимости от природы анализируемого биологического объекта (непосредственно опухолевый очаг; кровь; естественные выделения организма - моча, кровь, слюна и т.п.) детекция ДНК-маркеров может служить разным целям, а именно прогноза и выбора оптимальных схем лечения, мониторинга опухолевого роста, ранней диагностики и, возможно, скрининга.
ДНК-маркеры опухоли. Полностью трансформированная опухолевая клетка обладает набором из нескольких (вероятно, шести) необходимых и достаточных фенотипических признаков: самообеспечение митогенными стимулами, нечувствительность к антимитогенным стимулам, способность избегать апоптоза, способность к индукции ангиогенеза, неограниченный репликативный потенциал, способность к тканевой инвазии и метастазированию [1]. За каждым из этих признаков стоит то или иное генетическое событие, которых, соответственно, тоже несколько (от 4 до 7 и более). Опухолевая трансформация, таким образом, представляет собой длительный (занимающий десятилетия) процесс накопления клеткой генетических дефектов [2]. С другой стороны, каждый из перечисленных признаков возникает как следствие не одного определенного, а различных генетических событий, т.е. может быть результатом повреждений разных генов. Из этого следует то важное обстоятельство, что комбинации генетических дефектов могут быть особыми в каждом отдельном случае (иными словами, возникновение и прогрессирование конкретной опухоли в генетическом отношении индивидуально). Вместе с тем, конкретные сочетания генетических дефектов могут наделять новообразование специфическими особенностями, отличающими одну от другой даже опухоли одного типа и гистогенеза, в силу чего чрезвычайно показателен ее так называемый "молекулярный профиль" (имеется в виду детальный анализ посредством "ДНК-чипов" совокупности поврежденных и экспрессирующихся клеточных генов). Эта технология будущего, позволяющая оценивать индивидуальные свойства конкретной опухоли (ее принадлежность к определенному подтипу, степень чувствительности к различным химиопрепаратам, способность к метастазированию и т.д.), способна, как полагают, произвести революцию в онкологии [3,4].
ДНК-маркеры естественных выделений. Значительную долю опухолей человека составляют раки, происходящие из выстилающего полости тела эпителия. Слущивающиеся опухолевые клетки попадают в просвет соответствующего органа и выносятся из организма. Выявление в естественных выделениях организма специфических ДНК-маркеров оказалось во многих случаях более чувствительным способом диагностики и мониторинга опухолей соответствующей полости тела, чем общеупотребительные методы (цитология, эндоскопия). Так, показана высокая диагностическая эффективность поиска ДНК-маркеров в моче (при раке мочевого пузыря и почек) [5,6]; в фекальных массах (при раке толстой кишки и пищеварительного тракта) [7]; в соке поджелудочной железы (при раке соответствующего органа) [8]; в слюне (при опухолях ротовой полости) [9]; в мокроте (при раке легких) [10].
ДНК-маркеры крови. Помимо слущивания в просвет органа, опухоль теряет клетки также вследствие непрерывного их распада (некротического и/или апоптотического). Некоторая часть ДНК распадающихся опухолевых клеток с характерными "родимыми пятнами" (т.е., специфическими дефектами) попадает в кровеносное русло и некоторое время циркулирует в нем. Несмотря на относительно малое количество "опухолевой" ДНК и ее значительное разбавление в большом объеме циркулирующей крови, современные высокочувствительные методы [различные модификации полимеразной цепной реакции (ПЦР)] способны их обнаруживать и тем самым сигнализировать об онкологическом неблагополучии.
Так, установлено, что в ДНК крови онкологических больных с самыми распространенными новообразованиями (головы, шеи, легких, желудка, печени, толстого кишечника, поджелудочной железы) присутствуют те же, что и в самой опухоли, мутантные последовательности [11-15]. В связи с тем, что ДНК-маркерам, в отличие от известных белковых маркеров, присущи высокая онкоспецифичность (т.е., непосредственная причинно-следственная связь с канцерогенезом) и универсальность (нет опухолевой клетки без того или иного генетического дефекта), появляются возможности общей (не зависящей от локализации опухоли) лабораторной диагностики, а также мониторинга онкологических заболеваний. Усилия многих лабораторий сосредоточены на их практической реализации.
Транс-ренальные ДНК-маркеры. У ДНК-диагностики рака, основанной на анализе крови, имеется альтернатива в виде аналогичного анализа ДНК мочи, имеющего два существенных преимущества: неинвазивность и практическая неограниченность исходного клинического материала. О такой возможности свидетельствовали наши предыдущие исследования, продемонстрировавшие проницаемость почечного барьера человека и экспериментальных животных по отношению к фрагментам клеточной ДНК, названным транс-ренальными ДНК (т.е., преодолевшими почечный барьер). Последние, как оказалось, могут быть использованы для ПЦР [16-18].
В исследовании двух групп больных (с аденокарциномами толстого кишечника и поджелудочной железы), проходивших лечение в клинике ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, мутации K-RAS (кодон 12) выявлены в составе транс-ренальной ДНК: в 4 случаях из 9 K-RAS-позитивных опухолей толстого кишечника и в 6 из 14 опухолей поджелудочной железы. Из 6 больных аденокарциномой поджелудочной железы с K-RAS-позитивной ДНК мочи у двух мы имели возможность провести анализ как до, так и после сеансов химиотерапии. Спустя 1-2 недели после проведенного лечения соответствующий сигнал (полоса мутантного онкогена) не был нами обнаружен в обоих случаях, что, возможно, свидетельствует о временном снижении числа опухолевых клеток в организме больного.
Таким образом, показана принципиальная пригодность данного способа (неинвазивного и не ограниченного количеством исходного клинического материала) для выявления растущей в организме опухоли. Оценка его возможностей и, главным образом, повышение чувствительности посредством совершенствования используемых методов является предметом дальнейших исследований.
Перспективы. Главная цель диагностических процедур в онкологии - как можно более раннее выявление опухоли (в идеале - еще до клинических проявлений). Отмеченные выше уникальные свойства ДНК-маркеров стимулируют попытки достижения поставленной цели (имеются в виду ранняя диагностика и скрининг) средствами генной технологии.
Теоретической предпосылкой таких попыток является обоснованное предположение о том, что опухоль в момент своего появления - не изолированный узелок, а лишь "вершина айсберга", зреющего в организме десятилетиями и состоящего из множества дефектных клеток на разных стадиях трансформации. Это положение, утверждающее не локальный, а общий характер онкологической патологии, основано, во-первых, на громадном клиническом опыте и концепции "предрака", предшествующего злокачественному новообразованию ("полностью трансформированная клетка, дающая начало опухоли, исходит из пластов фенотипически и генетически измененных клеток") [2], и, во-вторых, на общих положениях теоретической онкологии о механизмах канцерогенеза (о связи рака со старением, о длительном процессе накопления мутаций как механизме клеточной трансформации, о частоте мутационного процесса и т.п.) [1,2,19-21].
Весьма вероятно, таким образом, что по мере старения организма, увеличения мутагенной нагрузки и ослабления механизмов репарации растет и число дефектных (потенциально опасных в онкологическом отношении) клеток. Мишенью приложения геннодиагностических подходов могут быть поэтому не только и не столько клетки первичного опухолевого очага, число которых поначалу очень невелико и которых по этой причине невозможно выявить, а вся масса клеток-предшественников (т.е., находящихся на промежуточных стадиях трансформации). Не проявляющий себя клинически этот скрытый "айсберг" определяет, тем не менее, вероятность появления полностью трансформированной клетки и, в конечном итоге, вероятность возникновения опухолевого клона. На основе количественной оценки числа присутствующих в организме генетически дефектных клеток может быть создана система скрининга (формирования групп повышенного риска). Для реализации этой потенциальной возможности необходимо создание тестов, позволяющих, во-первых, оценивать присутствие ДНК-маркеров в биологических средах организма количественно, и, во-вторых, идентифицировать как "ранние", так и "поздние" маркеры (т.е., характерные для начальных и поздних этапов клеточной трансформации). Быстрый методический прогресс в данной области позволяет надеяться на реализацию этих возможностей в обозримом будущем.
Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант № 01-04-48463).
Список литературы:
1. Hanahan, D. and R. A. Weinberg. 2000. The hallmarks of cancer. Cell 100:57-70.
2. Loeb, L. A. 2001. A Mutator Phenotype in Cancer. Cancer Res 61:3230-3239.
3. Lakhani, S. R. and A. Ashworth. 2001. Microarray and histopathological analysis of tumors: the future and the past? Nat.Rev.Cancer 1:151-157.
4. Sidransky, D. 2002. Emerging molecular markers of cancer. Nat.Rev.Cancer 2:210-219.
5. Christensen, M., H. Wolf, and T. F. Orntoft. 2000. Microsatellite alterations in urinary sediments from patients with cystitis and bladder cancer. Int.J.Cancer 85:614-617.
6. Conejo, J.R., T. Parra, M. Cantero, A. Jimenez, V. Granizo, G. de Arriba, and F. Carballo. 1998. Detection of H-ras mutations in urine sediments by a mutant-enriched PCR technique. Clin.Chem. 44:1570-1572.
7. Sidransky, D., T. Tokino, S. R. Hamilton, K. W. Kinzler, B. Levin, P. Frost, and B. Vogelstein. 1992. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumors. Science 256:102-105.
8. Tada, M., M. Omata, S. Kawai, H. Saisho, M. Ohto, R. K. Saiki, and J. J. Sninsky. 1993. Detection of ras gene mutations in pancreatic juice and peripheral blood of patients with pancreatic adenocarcinoma. Cancer Res. 53:2472-2474.
9. Boyle, J. O., L. Mao, J. A. Brennan, W. M. Koch, D. W. Eisele, J. R. Saunders, and D. Sidransky. 1994. Gene mutations in saliva as molecular markers for head and neck squamous cell carcinomas. Am.J.Surg. 168:429-432.
10. Mao, L., R. H. Hruban, J. O. Boyle, M. Tockman, and D. Sidransky. 1994. Detection of oncogene mutations in sputum precedes diagnosis of lung cancer. Cancer Res. 54:1634-1637.
11. Anker, P., H. Mulcahy, X. Q. Chen, and M. Stroun. 1999. Detection of circulating tumor DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 18:65-73.
12. Chen, X. Q., M. Stroun, J. L. Magnenat, L. P. Nicod, A. M. Kurt, J. Lyautey, C. Lederrey, and P. Anker. 1996. Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat.Med. 2:1033-1035.
13. Mulcahy, H. E., J. Lyautey, C. Lederrey, X. Q. Chen, P. Anker, and E. M. Alstead. 1998. A prospective study of K-ras mutations in the plasma of pancreatic cancer patients. Clin.Cancer Res. 4:271-275.
14. Mulcahy, H. E., J. Lyautey, C. Lederrey, X. Q. Chen, F. Lefort, V. Vasioukhin, P. Anker, E. M. Alstead, M. J. Farthing, and M. Stroun. 2000. Plasma DNA K-ras mutations in patients with gastrointestinal malignancies. Ann.N.Y.Acad.Sci. 906:25-28.
15. Nawroz, H., W. Koch, P. Anker, M. Stroun, and D. Sidransky. 1996. Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients. Nat.Med. 2:1035-1037.
16. Botezatu, I., O. Serdyuk, G. Potapova, V. Shelepov, R. Alechina, Y. Molyaka, V. Ananev, I. Bazin, A. Garin, M. Narimanov, V. Knysh, H. Melkonyan, S. Umansky, and A. Lichtenstein. 2000. Genetic analysis of DNA excreted in urine: a new approach for detecting specific genomic DNA sequences from cells dying in an organism. Clin.Chem. 46:1078-1084.
17. Моляка Ю.К., И.В. Ботезату, Г.И. Потапова, И.С. Косорукова, О.И. Сердюк, П. Алехина, В. П. Шелепов, В.С. Ананьев, Е.В. Огородникова, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, В.И. Кныш, А.В. Лихтенштейн. 2000. Анализ экскретируемой из организма ДНК как подход к выявлению растущей в организме опухоли. Вестник АМН 7:24-27.
18. Шелепов В.П., С.Л. Арсенин, И.В. Ботезату, Р.П. Алехина, Г.И. Потапова, О.С. Мелконян, С.Р. Уманский, А.В. Лихтенштейн. 1997. Возможность использования полимерной ДНК, происходящей из гибнущих в организме клеток и проходящей через почечный барьер, для генетического анализа. Вестник Российского онкологического научного центра РАМН 4:13-17.
19. DePinho, R. A. 2000. The age of cancer. Nature 408:248-254.
20. Strauss, E. 2002. Aging research: cancer-stalling system accelerates aging. Science 295:28-29.
21. Toyota, M. and J.-P. Issa. 1999. CpG island methylator phenotypes in aging and cancer. Seminars in Cancer Biology 9:349-357.
