Новости онкологии

21.03.2017

Определение микроскопической вязкости злокачественных клеток с помощью молекулярных роторов in vivo

Микроскопическая вязкость является одним из основных показателей, влияющих на скорость диффузии небольших молекул в полимере, и, как следствие этого, определяющая скорость зависимых от диффузии реакций на микроскопическом уровне. В связи с этим то значение, которое данный параметр играет в процессах жизнедеятельности клеток здорового организма, неоценимо. Его изменение, как на уровне клетки, так и всего организма, приводит к их нарушению и развитию заболеваний [1-7]. Неудивительно, что определение величины микроскопической вязкости на клеточном уровне представляет особую ценность [8]. На сегодняшний день основными методами ее нахождения являются флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS) [9-11], метод восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP) [12], метод измерения поляризации флуоресценции или анизотропии [13-15], измерение вязкости с помощью флуоресцентных молекулярных роторов [8, 16]. В настоящее время они широко используются для определения коэффициентов диффузии и вязкости в клетках живого организма и модельных жировых системах. В отличие от других методов, флуоресцентные молекулярные роторы позволяют не только точно измерять вязкость, но и делать это в режиме реального времени [8].

Молекулярные роторы представляют собой малые синтетические флюорофоры, в которых параметры флуоресценции тесным образом зависят от микроскопической вязкости окружающей их среды [8, 16]. Определение флуоресценции с помощью молекулярных роторов позволяет избежать ряд трудностей, связанных с нахождением концентрации неизвестного флюорофора. С их помощью была получена бесценная информация о биологических процессах, происходящих в модельных жировых системах [17-19], бактериальных [20-22] и эукариотических клетках, а также клеточных органеллах [23-33]. Более того, с помощью них была определена микроскопическая вязкость при перекисном окислении липидов [34], гибели клетки [31], спорообразовании бактерий [20-21], а также были оценены изменения вязкости мембраны бактериальной клетки при колебании температуры [22]. Несмотря на это, все вышеперечисленные методы определения вязкости, включая измерение ее с помощью флуоресцентных молекулярных роторов, позволяют оценить ее только in vitro. Вплоть до настоящего времени исследований по определению ее уровня in vivo не было.

Целью совместной работы российских и британских авторов, опубликованной в журнале Scientific Reports (Nature) [40], была разработка метода, позволяющего определить уровень микроскопической вязкости в отдельно взятых злокачественных клетках и тканях у лабораторных мышей in vivo. За основу был взят метод оценки вязкости с помощью флуоресцентных молекулярных роторов.

Спектроскопическая характеристика молекулярных роторов

Роль молекулярных роторов на основе BODIPY (борфторидные комплексы дипирролилметенов) в определении микроскопической вязкости была доказана на примере различных микрогетерогенных систем in vitro. Особое значение для данной работы представляет их использование для оценки вязкости в клеточных органеллах, в том числе в плазматических мембранах клеток живых организмов [8, 29]. Более того, молекулярные роторы на основе BODIPY широко применяются для определения вязкости в режиме реального времени [35]. При проведении данного исследования авторами были выбраны молекулярные роторы BODIPY1 и BODIPY2, эффективность которых была доказана как в модельных системах [17, 19], так и в плазматических мембранах клеток живых организмов [29, 32, 33] (рис. 1).

Строение молекулярных роторов BODIPY1 и BODIPY2, а также полимерной щетки, используемой для растворения BODIPY1

Рисунок 1. Строение молекулярных роторов BODIPY1 и BODIPY2,
а также полимерной щетки, используемой для растворения BODIPY1.

Исследователи отметили, что большинство молекулярных роторов на основе BODIPY являются гидрофобными молекулами (за исключением BODIPY2). В связи с этим для проведения с ними опытов in vivo требуется солюбилизирующий агент. Последнее явилось причиной того, что вначале авторами работы были оценены свойства этих роторов в растворах с высокой концентрацией солюбилизирующих полимерных щеток (строение показано на рисунке 1), эффективность которых была ранее доказана in vivo [36]. Исследователями было выявлено, что через 24 часа при соотношении 1:1 (BODIPY1 : полимерные щетки) происходит полное растворение BODIPY1.

При проведении опытов in vitro авторами были выбраны различные соотношения BODIPY и полимерных щеток: I) BODIPY1 с низкой концентрацией щеток, что позволяло BODIPY1 практически полностью раствориться (10:1); II) BODIPY1 с высокой концентрацией щеток, что позволяло BODIPY1 полностью раствориться; III) раствор BODIPY2 в воде.

Определение микроскопической вязкости в клетках линии CT26 in vitro

Сначала авторы исследования ввели растворы BODIPY1 и BODIPY2 в культивируемые клетки линии CT26 (колоректальный рак) мышей (рис. 2). Во всех клетках была выявлена яркая флуоресценция, характерная для BODIPY. В то время как при соотношении I наблюдалась точечная флуоресценция, при соотношениях II и III была видна четко окрашенная цитоплазматическая мембрана.

Изображения CT26 клеток, выявленные методами двухфотонной (TPE) флуоресценции и время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) после инъекции BODIPY1 и BODIPY2

Рисунок 2. Изображения CT26 клеток, выявленные методами двухфотонной (TPE) флуоресценции
и время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) после инъекции BODIPY1 и BODIPY2.

Во II и III случаях затухание флуоресценции носило моноэкспоненциальный характер, в то время как в I – биэкспоненциальный. Микроскопическая вязкость мембраны в CT26 клетках составила 184±11 cP (II) и 377±27 cP (III) соответственно. Несмотря на то, что роторы BODIPY1 и BODIPY2 занимают одинаковое положение в липидном слое [17], величина вязкости, определяемая BODIPY1, была значительно ниже. Авторами было предположено, что полимерная щеточка повреждает структуры цитоплазматической мембраны, делая ее менее вязкой [37, 38]. Данные особенности должны быть приняты во внимание при интерпретации результатов in vitro и in vivo [39].

Накопление и расход молекулярных роторов in vivo

Убедившись в том, что BODIPY1 и BODIPY2 взаимодействуют с культивируемыми опухолевыми клетками CT26, авторами исследования были изучены процессы их накопления и расход в злокачественных клетках. Учеными было выявлено, что внутривенное введение BODIPY1 без полимерных щеток (8 мг/кг; 5% диметилсульфоксид [ДМСО]) не вызывает появление флуоресценции. Введение водного раствора BODIPY2 (III) и BODIPY1 с низкой концентрацией щеток (I) вызывало флуоресценцию в опухоли, которая в то же время не отражала специфичный характер накопления роторов (рис. 3). При введении BODIPY2 была отмечена максимально выраженная флуоресценция опухоли, сохранявшаяся в течение 15 мин. – 6 часов после инъекции. При введении BODIPY1 наиболее высокий уровень флуоресценции был достигнут через 6 часов после инъекции. Оба ротора оставались в опухоли в относительно высокой концентрации через 24 часа после введения.

Накопление молекулярных роторов BODIPY1 и BODIPY2 в злокачественных клетках CT26 in vivo

Рисунок 3. Накопление молекулярных роторов BODIPY1 и BODIPY2
в злокачественных клетках CT26 in vivo.

Изображение флуоресценции (А, С) и ее кинетика (B, D) после введения BODIPY2 (A, B) и BODIPY1 (I) (С, D).

При проведении более подробного анализа ex vivo оказалось, что наиболее высокая концентрация роторов была в органах, через которые проходила их экскреция – кишечник, печень и кожа. При введении BODIPY2 в процесс экскреции были также вовлечены почки. Снижение концентрации BODIPY2 в остальных органах и тканях происходило в следующей последовательности: опухоль → легкие → мышцы → сердце → селезенка. Снижение концентрации BODIPY1 происходило в следующей последовательности: мышцы → опухоль → сердце → почки → легкие → селезенка.

При анализе кинетики BODIPY2 и BODIPY1 в плазме крови было выявлено постепенное снижение их концентрации с полной элиминацией из кровотока через 48 часов после инъекции. Необходимо отметить, что введение роторов не сопровождалось развитием острых нежелательных реакций у мышей.

Определение вязкости в злокачественных клетках CT26 in vivo

На следующем этапе авторы исследования получили изображения, определенные методом время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy – FLIM) в злокачественных клетках мышей после инъекции BODIPY1 и BODIPY2. Во всех случаях была выявлена яркая двухфотонная флуоресценция и изображения FLIM (рис. 4). После введения BODIPY1 (I) наблюдался биэкспоненциальный распад ротора как в опухоли, так и в окружающей ткани.

Изображения CT26 клеток in vivo, выявленные методами двухфотонной (TPE) флуоресценции и время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) через 40 минут после введения BODIPY1 и через 60 минут после введения BODIPY2

Рисунок 4. Изображения CT26 клеток in vivo, выявленные методами
двухфотонной (TPE) флуоресценции и время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM)
через 40 минут после введения BODIPY1 и через 60 минут после введения BODIPY2.

Интересно, что после введения BODIPY1 (II) наблюдался биэкспоненциальный распад ротора в злокачественных клетках и моноэкспоненциальный – в окружающей ткани.

Для того чтобы убедиться в том, что присутствие полимерных щеток in vivo не влияет на вязкость коллагена, авторы исследования определили время флуоресценции BODIPY1 и BODIPY2 в гидрогелях коллагена in vitro (рис. 5). Оказалось, что после введения BODIPY2 (III) наблюдался биэкспоненциальный распад ротора в коллагене, что соответствовал таковому in vivo. Напротив, после введения BODIPY1 был выявлен моноэкспоненциальный распад (рис. 5). В присутствии полимерных щеток время жизни флуоресценции BODIPY1 составило 2.79±0.15 нс (вязкость 429±51 cP). Без полимерных щеток аналогичные показатели составили 2.22±0.06 нс (260±15 cP). Таким образом, вязкость коллагена может быть определена после введения BODIPY1 in vitro, но не после введения BODIPY2. Более того, по аналогии с культивируемыми клетками, на величину вязкости коллагена in vitro влияло присутствие полимерных щеток. Напротив, последние не оказывали влияние на вязкость окружающих тканей in vivo.

Введение водорастворимого BODIPY2 (III) в хвостовую вену мыши сопровождалось моноэкспоненциальным распадом флуоресценции в опухоли (время испускания флуоресценции составило 2.67±0.06 нс; рис. 4). Показатели, зарегистрированные в клетках опухоли in vivo, соответствовали времени жизни флуоресценции в культивируемых клетках CT26 и значению вязкости, определенной в клетках in vitro (386±19 cP). Вязкость среды не изменялась при измерении ее in vivo в течение 20-80 минут после введения BODIPY2. Значения вязкости, определенные in vivo и in vitro суммированы в табл. 1.

Изображения коллагеновых волокон, выявленных методами двухфотонной (TPE) флуоресценции и время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) после введения BODIPY1 и BODIPY2

Рисунок 5. Изображения коллагеновых волокон, выявленных методами двухфотонной (TPE) флуоресценции и время-разрешенной флуоресцентной микроскопии (FLIM) после введения BODIPY1 и BODIPY2.


Таблица 1. Показатели вязкости, определенные in vitro и in vivo
с использованием молекулярных роторов BODIPY.

  BODIPY 1 (ДМСО) BODIPY 1 (I) BODIPY 1 (II) BODIPY 2 (III)
IN VITRO
Злокачественные клетки 1.6 нс/160±20 cP [32, 33] Биэкспоненциальный распад 1.90±0.05 нс/184±11 cP 2.64±0.09 нс/377±27 cP
Коллаген 2.22±0.06 нс/260±15 cP Не обнаружен 2.79±0.15 нс/429±51 cP Биэкспоненциальный распад
IN VIVO
Злокачественные клетки Не обнаружен Биэкспоненциальный распад Биэкспоненциальный распад 2.67±0.06 нс/386±19 cP
Коллаген Не обнаружен Биэкспоненциальный распад 2.24±0.06 нс/265±16 cP Биэкспоненциальный распад

Таким образом, авторами исследования было выявлено, что величина вязкости, определенная в клетках опухоли in vivo, соответствует ее значению in vitro. Новый метод позволил не только измерять вязкость в живых организмах, но и следить за ее изменениями в режиме реального времени. Последнее представляется особенно важным для диагностики и оценки результатов лечения, о которых возможно будет судить по изменениям микроскопической вязкости.


Литература:

  1. Deliconstantinos G, Villiotou V, Stavrides JC. Modulation of particulate nitric oxide synthase activity and peroxynitrite synthesis in cholesterol enriched endothelial cell membranes. Biochem. Pharmacol. 1995; 49: 1589.
  2. Klaver JHJ, Greve EL, Goslinga H, et al. Blood and plasma viscosity measurements in patients with glaucoma. Brit. J. Ophthalmol. 1985; 69, 765-770.
  3. Nadiv O, et al. Elevated protein tyrosine phosphatase activity and increased membrane viscosity are associated with impaired activation of the insulin receptor kinase in old rats. Biochem. J. 1994; 298 (part 2): 443-450.
  4. Rosencranz R, Bogen SA. Clinical laboratory measurement of serum, plasma, and blood viscosity. Am. J. Clin. Pathol. 2006; 125: 78-86.
  5. Shinitzky M. Membrane fluidity and cellular functions, In Shinitzky, M. (Ed.), Physiology of Membrane Fluidity. CRC Press, Boca Raton. 1984; 1: 1-51.
  6. Singer, SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 1972; 175: 720.
  7. Zubenko GS, Kopp U, Seto T, et al. Platelet membrane fluidity individuals at risk for Alzheimer’s disease: a comparison of results from fluorescence spectroscopy and electron spin resonance spectroscopy. Psychopharmacology. 1999; 145: 175.
  8. Kuimova MK. Mapping viscosity in cells using molecular rotors. Phys. Chem. Chem. Phys. 2012; 14: 12671-12686.
  9. Kapusta P, Wahl M, Benda A, et al. Fluorescence lifetime correlation spectroscopy. J. Fluorescence. 2007; 17: 43-48.
  10. Korlach J, Schwille P, Webb WW, et al. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999; 96: 8461-8466.
  11. Thompson NL, Lieto AM, Allen NW. Recent advances in fluorescence correlation spectroscopy. Curr. Op. Struct. Biol. 2002; 12: 634-641.
  12. Dayel MJ, Hom EFY, Verkman AS. Diffusion of green fluorescent protein in the aqueous-phase lumen of endoplasmic reticulum. Biophys. J. 1999; 76: 2843.
  13. Dix JA, Verkman AS. Mapping of fluorescence anisotropy in living cells by ratio imaging. Application to cytoplasmic viscosity. Biophys. J. 1990; 57: 231-240.
  14. Fushimi K, Verkman AS. Low viscosity in the aqueous domain of cell cytoplasm measured by picosecond polarization microfluorimetry. J. Cell Biol. 1991; 112: 719-725.
  15. Siegel J, et al. Wide-field time-resolved fluorescence anisotropy imaging (TR-FAIM): Imaging the rotational mobility of a fluorophore. Rev. Sci. Instrum. 2003; 74: 182-192.
  16. Haidekker MA, Theodorakis EA. Molecular rotors-fluorescent biosensors for viscosity and flow. Org. Biomol. Chem. 2007; 5: 1669-1678.
  17. Dent MR, et al. Imaging phase separation in model lipid membranes through the use of BODIPY based molecular rotors. Phys. Chem. Chem. Phys. 2015; 17: 18393-18402.
  18. Nipper ME, Dakanali M, Theodorakis E, et al. Detection of liposome membrane viscosity perturbations with ratiometric molecular rotors. Biochimie. 2011; 93: 988-994.
  19. Wu, Y. et al. Molecular rheometry: direct determination of viscosity in Lo and Ld lipid phases via fluorescence lifetime imaging. Phys. Chem. Chem. Phys. 2013; 15: 14986-93.
  20. Loison P, Gervais P, Perrier-Cornet J-M, et al. Effect of ethanol perturbation on viscosity and permeability of an inner membrane in Bacillus subtilis spores. Biochim. Biophys. Acta-Biomembranes. 2016; 1858: 2060-2069.
  21. Loison P, Hosny NA, Gervais P, et al. Direct investigation of viscosity of an atypical inner membrane of Bacillus spores: a molecular rotor/FLIM study. Biochim. Biophys. Acta-Biomembranes. 2013; 1828: 2436-2443.
  22. Mika JT, et al. Measuring the viscosity of the Escherichia coli plasma membrane using molecular rotors. Biophys J. 2016; 111(7): 1528-1540.
  23. Peng XJ, et al. Fluorescence ratiometry and fluorescence lifetime (FLIM) imaging: Dual mode imaging cellular viscosity by a single molecular rotor. J. Am. Chem. Soc. 2011; 133: 6626-6635.
  24. Gatzogiannis E, et al. Mapping protein-specific micro-environments in live cells by fluorescence lifetime imaging of a hybrid genetic-chemical molecular rotor tag. Chem. Commun. 2012; 48: 8694-8696.
  25. Wang L, Xiao Y, Deng L. Activatable rotor for quantifying lysosomal viscosity in living cells. J. Am. Chem. Soc. 2013; 135: 2903-2906.
  26. Yang Z, et al. A self-calibrating bipartite viscosity sensor for mitochondria. J. Am. Chem. Soc. 2013; 135: 9181-9185.
  27. Jiang N, et al. Dual mode monitoring probe for mitochondrial viscosity in single cell. Sensors Actuators B Chem. 2014; 190: 685-693.
  28. Chen S, et al. Mapping live cell viscosity with an aggregation‐induced emission fluorogen by means of two‐photon fluorescence lifetime imaging. Chem. A Eur. J. 2015; 21: 4315-4320.
  29. Lopez-Duarte I, et al. A molecular rotor for measuring viscosity in plasma membranes of live cells, Chem. Commun. 2014; 50: 5282-5284.
  30. Izquierdo MA, et al. Dual use of porphyrazines as sensitizers and viscosity markers in photodynamic therapy. J. Mater. Chem. B. 2015; 3: 1089-1096.
  31. Kuimova MK, Botchway SW, Parker AW. Imaging intracellular viscosity of a single cell during photoinduced cell death. Nature Chem. 2009; 1: 69-73.
  32. Levitt JA, Kuimova MK, Yahioglu G. Membrane-bound molecular rotors measure viscosity in live cells via fluorescence lifetime imaging. C. J. Phys. Chem. 2009; 113: 11634-11642.
  33. Kuimova MK, Yahioglu G, Levitt JA. Molecular rotor measures viscosity of live cells via fluorescence lifetime imaging. J. Am. Chem. Soc. 2008; 130: 6672-6673.
  34. Vyšniauskas A, Qurashi M, Kuimova MK. Molecular rotor measures dynamic changes of lipid bilayer viscosity caused by oxidative stress. Chem. Eur. J. 2016; 22(37): 13210-13217.
  35. Vyšniauskas A, et al. Unraveling the effect of temperature on viscosity-sensitive fluorescent molecular rotors. Chem. Sci. 2015; 6: 5773-5778.
  36. Yakimansky AV, et al. Novel regular polyimide-graft-(polymethacrylic acid) brushes: synthesis and possible applications as nanocontainers of cyanoporphyrazine agents for photodynamic therapy. J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem. 2013; 51: 4267-4281.
  37. Lehtonen JY, Kinnunen PK. Poly (ethylene glycol)-induced and temperature-dependent phase separation in fluid binary phospholipid membranes. Biophys J. 1995; 68(2): 525.
  38. Small EF, Willy MC, Lewin PA, et al. Ultrasound-induced transport across lipid bilayers: Influence of phase behavior. Colloids Surf. A. 2011; 390: 40-47.
  39. Carugo D, et al. Modulation of the molecular arrangement in artificial and biological membranes by phospholipid-shelled microbubbles. Biomaterials. in press, JBMT. 2016; 17771.
  40. Shimolina LE, Izquierdo MA, López-Duarte I, et al. Imaging tumor microscopic viscosity in vivo using molecular rotors. Sci Rep. 2017 Jan 30; 7: 41097.