В.П. Харченко, В.К. Боженко
ФГУ РНЦ Рентгенорадиологии Росздрава, Москва
В настоящее время общепринято, что основополагающими признаками неопластической клетки являются нарушения регуляции клеточного цикла и апоптоза. Известно, что регуляция процессов пролиферации клетки контролируется путем последовательной активации циклинов и соответствующих циклин-зависимых киназ (Cdk). Активность циклиновых киназ определяется уровнем экспрессии соответствующих циклинов и активностью специфических ингибиторов циклиновых киназ. Имеется несколько семейств ингибиторов циклиновых киназ. Наиболее изученными и практически важными из них являются р16INK4a, p21CIP/KIP, p27 KIP1. Мутации или гиперметилирование промоторов генов ингибиторов циклиновых киназах наблюдаются в 40-60% случаев злокачественных лимфом, при раке поджелудочной железы и ряде других злокачественных новообразований. Синтезирован ряд низкомолекулярных ингибиторов циклиновых киназ, и проходит их экспериментальное изучение как потенциальных противоопухолевых средств. Другим возможным направлением создания ингибиторов циклиновых киназ может быть использование функциональных последовательностей из соответствующих внутриклеточных ингибиторов. Белок р16 INK4a является одним из наиболее интересных кандидатов этой группы. Известно, что р16INK4a ингибирует циклин-зависимые киназы D и, тем самым, прохождение G1 фазы клеточного цикла. Показано, что его функция нарушена при широком спектре онкологических заболеваний. Другим возможным кандидатом на использование в качестве ингибитора пролиферации является белок р21, ингибирующий циклиновые киназы всех типов.
До настоящего времени проблему восстановления нарушенной функции пытались решать на основе методов доставки гена (генная терапия) (Георгиев Г.П., 2000; Wender Р.А. et al., 2000; Барышников А.Ю., 2004). Однако, эта технология до настоящего времени не получила широкого выхода в клиническую практику из-за ряда принципиальных проблем. В последнее время интерес к этому направлению опять возрос, и в печати появились экспериментальные работы, описывающие применение гена р16INK4a для терапии опухолей различного генеза (Lee A.W.C., Li J-H et. al., 2003; Liu S.X., Tang S.Q., Liang C.Y., 2003; Zhang Y., Liu J. et al., 2005).
Неудачи практического использования методов генной терапии послужили дополнительным мотивом к поиску новых технологических подходов для применения естественных белковых ингибиторов пролиферации. Возможным решением проблемы внутриклеточной доставки может являться открытие коротких последовательностей аминокислот (n=15-30), способных выполнять векторные функции. (Fawell S., Seery J. et al., 1994; Vives E., Brodin P., Lebleu B., 1997; Kaplan I.M. et al., 2005; Gupta B. et al., 2005; Fernandez-Carneado J. et al., 2005). Пептидные последовательности, обладающие внутриклеточной транспортной функцией, принято называть "интернализуемыми". В мировой литературе встречается также название «сell penetrating peptides» (CPP).
Альтернативный способ решения проблемы доставки функциональных последовательностей, основанный на технологии пептидных векторов, обладающих способностью проникать в клетки, не повреждая плазматическую мембрану, является весьма перспективным ввиду слабой иммуногенности таких соединений и способности переносить достаточно крупные молекулы. Соединение возможности целевой доставки пептидов в клетку и обнаружение коротких функциональных доменов в белках регуляторах различных клеточных функций создали предпосылки для конструирования молекул, имеющих конкретную патогенетическую направленность (Schutze-Redelmeier M.P. и др., 2004; Trehin R., Merkle H.P., 2004; Cong-Mei Wu и др., 2004). Относительная простота синтеза таких молекул позволяет говорить о принципиальной возможности создания на их основе индивидуальных химиопрепаратов, влияющих на патологические изменения свойственных данной конкретной опухоли (Perea S.E. и др., 2004).
Основные свойства, объединяющие различные по структуре пептиды в этот класс заключаются в следующем:
В табл. 1 приводятся примеры соединений, для которых показана возможность внутриклеточной доставки с помощью пептидных векторов.
Таблица 1.
Примеры частиц, которые могут быть добавлены в клетки с помощью интернализуемых пептидов.
| Размер | Вид частиц |
|---|---|
| До 1 нм | Органические молекулы |
| 1-10 нм | Пептиды |
| 1-10 нм | Олигонуклеотиды |
| 10-50 нм | Полноразмерные белки |
| 40 нм | Магнитные наночастицы |
Интернализуемые пептидные последовательности можно классифицировать по происхождению. В табл. 2 приведены примеры наиболее изученных интернализуемых последовательностей, полученных из различных источников.
Таблица 2.
Примеры аминокислотных последовательностей некоторых интернализуемых пептидов.
| Название | Источник | Аминокислотная последовательность |
|---|---|---|
| Пептиды, полученные из белков | ||
| Пенетратин (Antp) | Белок Antennapedia Drosofila melanogaster | RQIKIWFQRRMKKWK |
| Фрагмент Tat (47-57) | Транскрипционный фактор, участвующий в репликации вируса СПИДа | YGRKKRRQRRR |
| Фрагмент Tat (48-60) | Транскрипционный фактор, участвующий в репликации вируса СПИДа | GRKKRRQRRRPPQ |
| VP-22 | Вирус-протеин капсида простого герпеса 22 | DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVE |
| Пептиды, основанные на сигнальных последовательностях | ||
| Kaposi FGF, или пептид, основанный на сигнальной последовательности II | Фактор роста фибробластов саркомы Капоши | AAVALLPAVLLALLAP |
| HIV-1 gp-41 | Гидрофобный терминальный домен белка gp-41 вируса СПИДа | GALFLGFLGAAGSTMGA |
| Grb2 | SH2-домен, src-гомологичный домен 2 | AAVLLPVLLAAP |
| Интегрин α3 | VTVLALGALAGVGVG | |
| Химерные и синтетические пептиды | ||
| Химерный пептид, основанный на сигнальной последовательности | Белок gp-41 вируса СПИДа + область сигнала ядерной локализации(NLS) антигена вируса Simian | GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV |
| Транспортан | Галанин + Мастопаран | GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL |
| Амфифильный модельный пептид | синтетический | KLALKLALKALKAALKLA |
| KALA | InfluenzaHA (hemagglutinin subunit) (1-20) | WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALACEA |
Интересно, что внутриклеточная локализация интернализуемых пептидов может существенно отличаться. Так, исследование внутриклеточной локализации фрагмента 47-57 из белка tat вируса СПИДа в зависимости от аминокислотного состава показало, что некоторые последовательности преимущественно накапливаются в определенных компартментах клетки. Этот факт создает предпосылки для адресной (например, внутриядерной) доставки функциональных последовательностей.
Наши исследования направлены на изучение механизма антипролиферативной активности химерных пептидов, включающих функциональный фрагмент ингибиторов циклиновых киназ из белков p16INK4a и р21 CIP/KIP и транспортные последовательности Antp, tat, VP22. Мы исследовали изменение свойств химерных пептидов в зависимости от их взаимного расположения, а также от длины векторной конструкции (использовался генно-инженерный вариант Antp). Основные результаты получены при работе на синхронизированных культурах клеток и могут быть суммированы следующим образом:
Таким образом, как литературные, так и наши собственные данные показывают эффективность предлагаемого нового технологического подхода для целевого воздействия на функции клетки и говорят о перспективности его использования для создания противоопухолевых препаратов, воздействующих на конкретное патологическое звено.
