НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ РАКА ТОЛСТОЙ КИШКИ
Н.А. Яицкий, С.В. Васильев, М.В. Дубина
СПбГМУ им. академика И.П. Павлова, Санкт-Петербург
Молекулярно-генетические исследования последних 10-20 лет выявили тесную связь злокачественной прогрессии опухолей толстой кишки с накоплением соматических нарушений (мутаций) генов, контролирующих клеточный рост. В механизмах активации онкогенов и инактивации генов-супрессоров в опухолевых клетках в основном принимают участие генетические нарушения. Большинство генов, определяющих развитие колоректального рака, прямо или опосредованно участвуют в регуляции клеточного цикла и/или сигнальной трансдукции в отдельных клетках. В то же время, клеточный рост, и что более важно – инвазивные свойства клеток, во многом зависят от функции генов белков, вовлеченных в поддержание гомеостаза межклеточных взаимодействий на тканевом уровне. Как в самих клетках опухолей толстой кишки, так и в клеточном окружении были выявлены нарушения ряда белков, ответственных за межклеточные взаимодействия. Более того, многие поверхностные молекулы и внутриклеточные сигнальные белки в разных комбинациях интенсивно изучаются с целью оценки их значимости для клинического прогноза и эффекта противоопухолевых препаратов у пациентов с опухолями толстой кишки.
В настоящее время основной методологией ДНК-диагностики заболеваний и поиска мутаций в генах с известной нуклеотидной последовательностью является использование методов, основанных на технологии полимеразной цепной реакции (ПЦР) для сравнительного анализа мутантных и нормальных последовательностей по ряду физических и химических характеристик. На практике эти методы как более простые в применении и относительно дешёвые используются для предварительного отбора биологических образцов, где могут быть не только выраженные мутационные изменениями длины, но и точечные мутации, небольшие делеции или инсерции в исследуемых генах. Независимо от метода обнаружения мутаций заключительным этапом генетического анализа должно быть секвенирование (определение нуклеотидной последовательности) для достоверного подтверждения и выявления точных молекулярных характеристик мутаций.
Межклеточные щелевые контакты (МЩК) представляют одну из форм межклеточного взаимодействия и являются ключевым структурно-функциональным фактором поддержания метаболического гомеостаза в органах и тканях. Этот тип контактов был впервые выявлен электронно-микроскопически в виде участков плотного соприкосновения латеральных мембран соседствующих клеток с пространством между мембранами не более 0,2 нм. МЩК – единственный путь прямого обмена биологически активными молекулами с молекулярной массой до 1кДа (ионы, нуклеотиды, АТФ, сАМФ, некоторые аминокислоты и даже пептиды) между цитоплазмами соседствующих клеток. И именно это делает МЩК вовлеченными практически во все процессы жизнедеятельности организма, определяет их ключевую роль в поддержании тканевого гомеостаза путем равномерного распределения молекулярных сигналов роста между соседствующими клетками.
Впервые предположение о важной роли нарушений МЩК в опухолевой трансформации было высказано в 60-х годах, сразу после обнаружения этих структур. Согласно классической теории W.R. Loewenstein (1987), межклеточные щелевые контакты определяют распространение факторов роста, особенно сигнальных молекул между клетками. Поэтому в случае отсутствия МЩК нарушается и гомеостаз клеточного роста. В 2003 г. J. Trosko предложил концепцию интегральной роли нарушений стволовых клеток и межклеточных щелевых контактов в канцерогенезе. Согласно этой концепции в норме рост плюрипотентных стволовых клеток регулируется негативными факторами роста и не образует функциональных МЩК. Для начала дифференцировки стволовым клеткам необходима экспрессия коннексинов и МЩК. Действительно большинство опухолей у животных и человека сопровождается нарушением экспрессии МЩК по сравнению с нормальной тканью, а сообщаемость культивируемых опухолевых клеток снижается при увеличении злокачественности клеточных линий. Экспериментально установлено также, что экспрессия МЩК может быть подавлена промоторами опухолевого роста или генами, вовлеченными в канцерогенез. С другой стороны, некоторые противоопухолевые препараты и хемопревентивные соединения стимулируют образование МЩК.
МЩК состоят из множества каналов, образованных двумя полуканалами (коннексонами) в каждой их соприкасающихся мембран. В свою очередь каждый коннексон является результатом сборки 6 молекул трансмембранных белков – коннексинов. Основным механизмом ингибирующего влияния функционально активных МЩК на опухолевый рост, по-видимому, является взаимодействие карбоксильного участка коннексинов с многочисленными цитоплазматическими белками, контролирующими пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Механизмы участия коннексинов в контроле клеточного цикла до конца не изучены. В то же время, трансфекция гена коннексина-43 в трансформированные клетки приводила к снижению экспрессии генов, регулирующих клеточный цикл: циклины A, D1, D2, циклин-зависимые киназы CDK5 и CDK6. Показано также прямое взаимодействие коннексинов с такими молекулами адгезии как Е-кадхерин, Wnt-1, ?-катенин, ZO-1, окклюдином и другими. Экспериментальные данные подтверждают опухоль-стмулирующее влияние генетических мутаций коннексинов при имплантации опухолевых клеток, трансфецированных мутированными генами коннексинов бестимусным мышам. Однако более ранние генетические исследования не обнаруживали достоверных мутационных изменений генов коннексинов в спонтанных злокачественных опухолях печени, молочной железы, гемангиосаркомах.
Недавно на базе кафедры хирургических болезней стоматологического факультета СПбГМУ им. академика И.П. Павлова в отделении колопроктологии городской больницы №9 г. Санкт-Петербурга и в сотрудничестве с Международным Агентством по исследованию рака, Лион, Франция (ВОЗ) с использованием методов, основанных на технологии ПЦР, в аденокарциномах толстой кишки нами были выявлены несколько видов стойких соматических мутаций гена коннексина 43. Мы предполагаем, что генетические изменения коннексина-43 на стадии прогрессии рака толстой кишки могут служить одним из подтверждений важной роли нарушений МЩК в патогенезе злокачественных новообразований и, очевидно, станут основой для разработки новых теорий канцерогенеза. Поэтому весьма интересно рассмотреть возможные перспективы дальнейших молекулярно-генетических исследований МЩК для диагностики и прогноза злокачественных новообразований толстой кишки.
Известно, что опухоль-специфические нарушения экспрессии коннексинов на разных уровнях образования МЩК используются в диагностике злокачественных новообразований различных локализаций. В частности, установлено, что выраженное снижение экспрессии мРНК коннексина-43 в гистологических образцах и в клеточных линиях рака молочной железы может быть показателем прогрессии этого заболевания как у животных, так и у человека. Важно отметь, что в данных исследованиях уровень экспрессии белка не зависел от таких значимых показателей пролиферации клеток молочной железы как концентрация эстрогена, прогестерона и состояние рецептора erbB2. Cнижение экспрессии коннексина-43 также было обнаружено при злокачественной прогрессии опухолей эндометрия и головного мозга.
В наших исследованиях мутации гена коннексина-43 обнаружены только в ДНК опухолевых клеток. Мутации не найдены в ДНК клеток крови. Это можно рассматривать как диагностический критерий при оценке злокачественности опухолей толстой кишки. Учитывая, что генетические нарушения коннексина-43 локализованы в области многофункционального карбоксильного участка молекулы, нами был проведен двойной иммунофлюоресцентный анализ срезов опухолей с поликлональными антителами к разным участкам молекулы коннексина-43. Одно из антител было высокоспецифичным для аминокислотной последовательности в области цитоплазматической петли (в позиции 119-142), другое - для аминокислотной последовательности в области карбоксильной части молекулы коннексина-43 (в позиции 363–382). При иммунофлюоресцентном анализе контрольных срезов установлено, что слизистая оболочка толстой кишки в норме отличается относительно равномерным распределением мест связывания обоих в мембранах клеток кишечного эпителия. На срезах опухолевых тканей скопления опухолевых клеток, экспрессирующих мутированный коннексин-43, обнаруживались по снижению иммуногенности карбоксильного участка белка. Кроме того, экспрессия мутированного коннексина-43 оказалась специфичной для злокачественных клеток, локализованных преимущественно в участках максимальных диспластических изменений и в инвазивном фронте опухолей. Эти результаты делают возможным использование иммуногистохимической детекции мутированного коннексина-43 для ранней диагностики злокачественной прогрессии рака толстой кишки.
Достоверные мутационные изменения коннексинов, обнаруженные нами в аденокарциномах толстой кишки, позволяют предположить, что опухоли других локализаций также могут иметь генетические изменения МЩК, обнаружение которых возможно при совершенствовании методов исследований и методологии поиска генетических мутаций. Так, скрининговые методы, основанные на ПЦР технологии, обладают определённым порогом чувствительности как по показателю выявляемости мутаций (в среднем от 80% до 95%), так и по размеру участка ДНК, доступного для анализа (от 180 до 1700 пар нуклеотидов). Причем увеличение чувствительности каждого метода, как правило, сопровождается его удорожанием и техническим усложнением. Поэтому можно предположить, что если в исследуемых опухолях присутствует 5-10% клеток с мутациями генов коннексинов, они могут остаться незамеченными («скрытыми») по причине некорректного отбора образцов для секвенирования. Это обстоятельство особенно важно, так как опухоль представляет собой неоднородную ткань, которая, помимо нормального клеточного окружения, содержит различные клоны раковых клеток, отличающиеся по фенотипическим и генетическим признакам. Метод клонирования генов из общей ДНК опухолевой ткани, основанный на создании рекомбинантных плазмид и размножении их в бактериальных клетках, является незаменимым при поиске новых видов онкогенетических нарушений, даже если в исследуемой опухоли присутствует всего несколько клеток с искомыми генетическими отклонениями. Поэтому с точки зрения ранней ДНК-диагностики клонирование линий опухолевых клеток, полученных из участка злокачественного новообразования in vivo, может стать одним из высокоточных методов верификации индивидуального молекулярно-генетического профиля опухолей человека, в том числе, поиск генетических нарушений коннексинов у пациентов с опухолями толстой кишки.
Генная терапия представляет один из инновационных подходов в лечении рака толстой кишки. В настоящее время это направление активно развивается, в том числе и в генотерапии колоректального рака, при которой наиболее перспективным считается подход, направленный на коррекцию единичных генетических дефектов, которые вызывают фенотипические изменения в клетках. Согласно данным литературы, большинство линий опухолевых клеток in vitro утрачивают опухолевые свойства после трансфекции в них генов коннексинов. Основной проблемой геннотерапевтических подходов к лечению рака по-прежнему остается невозможность переноса генных конструкций в структуру ДНК всех соматических клеток-мишеней in vivo. Тем не менее, недавно были получены успешные результаты, свидетельствующие о возможности противоопухолевого воздействия путем соматической трансфекции гена коннексина-43 in vivo. Показано, что введение вектора кДНК с геном коннексина 43 в мозг крыс приводил к торможению роста имплантационных глиом С6.
Таким образом, сопоставление результатов наших исследований и литературных данных позволяет предположить, что дальнейшие исследования генетических нарушений коннексина-43 в опухолевых клетках при колоректальном раке являются высокоинформативными при изучении патогенеза опухолевого роста, совершенствовании методов ранней диагностики, разработке технологий лечения рака толстой кишки и других злокачественных новообразований.
