ХРОМОСОМНЫЙ АНАЛИЗ В ПРОГНОЗИРОВАНИИ ОСТРОГО НЕЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА
Е.В. Флейшман
Российский онкологический научный центр им Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Еще в конце 80-х - начале 90-х годов был сделан вывод о том, что хромосомный анализ является одним из важнейших прогностических методов при остром нелимфобластном лейкозе (ОНЛЛ). Этот вывод подтвержден данными больших многоцентровых исследований самых последних лет (Grimwade et al., 1998; Kern et al, 2000; Slovak et al, 2000, Visani et al., 2001).
Настоящее сообщение посвящено возможностям цитогенетического анализа и его месту среди других прогностических критериев. Представлен обзор специальной литературы и собственные данные, полученные в лаборатории цитогенетики ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в тесном сотрудничестве с врачами гематологических отделений как онкологического центра, так и других клиник Москвы (355 случаев ОНЛЛ).
Изменения кариотипа, характерные для ОНЛЛ, принято делить на три группы в зависимости от их прогностического значения. Первая группа включает хромосомные аномалии, предвещающие хороший ответ на лечение, в ней доля больных с безрецидивной 5-летней выживаемостью составляет 60-70%. В группе с плохим прогнозом этот показатель не превышает 10-15%. Остальные изменения кариотипа аcсоциированы с "промежуточным" ответом на лечение (Grimwade et al., 1998). Прогностическое значение отдельных хромосомных аномалий можно выяснить только при сравнении групп больных, получавших одинаковое лечение. Например, до 1991 года в отделении детской гематологии нашего центра 16 детей с прогностически благоприятной хромосомной транслокацией t(8;21) получили лечение по протоколу "7+3", а после 1991 года 12 детей с этой же аномалией получили лечение по модифицированному протоколу BFM-87. У подавляющего большинства пациентов получены полные ремиссии. Безрецидивная 5-летняя выживаемость в первой группе составила 15,3±10%, а во второй - 58,3±20% (р=0,03).
Разделение большой неоднородной группы острых миелоидных лейкозов на три прогностические подгруппы в зависимости от особенностей кариотипа предложено около 20 лет назад (Heim et Mitelman, 1995). За прошедшие годы классификация изменилась и продолжает меняться. Это обусловлено накоплением новых знаний о клиническом значении неслучайных хромосомных аномалий.
В настоящее время к изменениям кариотипа, имеющим благоприятное прогностическое значение, относят хромосомные транслокации t(8;21)(q22;q22), t(15;17)(q22;q21), t(16;16)(p13;q22) и инверсию хромосомы 16 - inv(16)(p13;q22). В группу цитогенетических изменений, имеющих неблагоприятное прогностическое значение, включают изменения длинного плеча хромосомы 3, затрагивающие районы 3q21 и /или 3q26, утраты хромосом пятой и седьмой пар, делеции длинного плеча хромосомы 5, транслокации t(6;9)(p23;q34) и t(9;22)(q34;q13), различные перестройки короткого плеча хромосомы 17 и сложные изменения кариотипа, то есть лейкозы с тремя или более хромосомными нарушениями. Все остальные случаи попадают в группу промежуточного прогноза. Остановимся на некоторых новых данных, важных для клинической практики.
В большинстве зарубежных клиник и в многоцентровых исследованиях все изменения хромосомного района 11q23 относят к прогностически неблагоприятным. Известно, что изменения этого района крайне многообразны, в частности, описаны хромосомные транслокации района 11q23 более чем с 40 различными участками кариотипа. Каждая из названных аномалий, хотя и представляет цитогенетически однородную группу, может затрагивать разные гены, а это обусловливает различия в чувствительности к химиопрепаратам.
Цитогенетические изменения, выглядящие при световой микроскопии абсолютно идентичными, оказываются разными, когда для их изучения используются молекулярно-генетические методики, такие как флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) и полимеразная цепная реакция (PCR). С помощью этих методов установлено, что при ОНЛЛ имеют место еще более разнообразные генетические изменения, чем это было обнаружено при стандартном хромосомном анализе. К настоящему времени накопились факты, не позволяющие включать все изменения района 11q23 в группу прогностически неблагоприятных аномалий кариотипа. Уже с середины 90-х годов публикуются серии наблюдений, свидетельствующие о хорошем эффекте лечения лейкозов с транслокацией t(9;11) (Mrozek et al., 1997, Swansbury et al., 1998; Pui et al, 2000): пятилетняя выживаемость составила 60-70%, то есть является такой же, как в группе с прогностически благоприятными изменениями кариотипа.
Недавние международные многоцентровые исследования, включающие большие серии (сотни случаев) одинаково леченных ОНЛЛ, позволили придти к выводу о том, что прогноз при ОНЛЛ с перестройками, вовлекающими район 11q23, определяется не только генами, локализованными в этом районе, но и вторым участником транслокации.
Еще один пример - транслокация t(10;11)(p12-13;q23). Это очень редкая аномалия (1-2% ОНЛЛ). У подавляющего большинства пациентов с транслокациями t(9;11)(p22;q23) и t(10;11)(p12-13;q23) одним из генов-участников является ген MLL. При транслокации t(9;11) известен только один возможный партнер гена MLL, при участии которого возникает слитный (химерный, гибридный) ген. В то же время молекулярно-генетическое изучение транслокации t(10;11)(p12-13;q23) обнаружило уже 4 гена. Это гены MLL и CALM, локализованные в районе 11q23, и гены AF10 и ABI1, локализованные в районе 10p12-13. Данные о длительности жизни при лейкозе с хромосомной транслокацией t(10;11) пока весьма немногочисленны. В литературе есть сведения менее чем о 100 больных, получавших разное лечение. Обращает на себя внимание большая вариабельность показателей выживаемости: у одних пациентов рецидив наступил на втором месяце от начала ремиссии, другие пережили 5 лет. Молекулярно-генетические исследования проводились не всегда, однако, создается впечатление, что химерный ген ABI1-MLL ассоциирован со значительно более благоприятным прогнозом, чем другие химерные гены, возникающие при транслокации t(10;11) (Shibuya et al., 2001).
Следующий вопрос, требующий обсуждения, касается гетерогенности прогностических групп, выделенных на основании особенностей кариотипа, и, в частности, группы с благоприятным прогнозом. Как известно, 5-летняя выживаемость у больных этой группы составляет 60-70%. До начала лечения или в период клинико-гематологической ремиссии невозможно предсказать, кто именно попадет в эти 60-70%, а у кого разовьется ранний рецидив. Однако известен целый ряд клинических показателей, ассоциированных с худшим прогнозом, а именно с более частым развитием ранних рецидивов при ОНЛЛ. Среди таких показателей следует отметить экспрессию антигена CD56 на бластных клетках, недостаточное снижение количества бластных элементов в костном мозге на 14-21 день лечения, дополнительные аномалии кариотипа, высокий лейкоцитоз на момент установления диагноза (Schoch et al, 1996; Baer et al., 1997; Daniels et al., 1999; Peniket et al., 1999; Ferrara et al., 2000). Имеются также сообщения о том, что признаки дисплазии клеток остаточного (нелейкозного) эритроидного и мегакариоцитарного ростков костного мозга до лечения предвещают невысокую эффективность терапии при ОНЛЛ de novo (Tamura et al., 1998; Lemez et al., 2000). Относится ли это к лейкозам из благоприятной прогностической группы, пока не ясно. Выявление в каждом случае ОМЛ прогностически неблагоприятных симптомов еще на этапе постановки диагноза может оказаться полезным для оптимизации протоколов лечения.
Индивидуальный прогноз, то есть риск развития рецидива и время его наступления у конкретного больного ОНЛЛ невозможно оценить, не проводя молекулярный мониторинг минимальной резидуальной болезни (МРБ). Лейкозные клетки, сохранившиеся, несмотря на применение цитостатической терапии и персистирующие во время полной клинико-гематологической ремиссии, составляют биологический субстрат минимальной резидуальной болезни. Эти клетки не выявляются при клинических анализах крови и костного мозга, но обнаруживаются с помощью более чувствительных методов, среди которых на первом месте стоит полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (РТ-ПЦР). Установлена тесная связь МРБ с прогнозом заболевания. Показано, что частота рецидивов значительно выше в группе больных, где удается обнаружить минимальную резидуальную болезнь по сравнению с группой пациентов, где МРБ не выявляется. Кроме того, установлено, что, чем больше количество оставшихся лейкозных клеток, тем меньше сроки от начала ремиссии до наступления рецидива (Radich, 2000). Новые количественные методики ПЦР позволяют проводить мониторинг МРБ лучше, чем качественные модификации (Tobal et al, 2000). Введены новые понятия "молекулярная ремиссия" и "молекулярный рецидив". Показано, что при достижении гематологической ремиссии происходит значительное снижение уровня транскрипта химерного гена. Во время гематологической ремиссии определяется постоянная низкая экспрессия химерного транскрипта или ПЦР-негативность, то есть имеет место молекулярная ремиссия. За 4-6 месяцев до истинного рецидива уровень транскрипта существенно повышается, то есть наблюдается молекулярный рецидив.
Транслокация t(8;21)(q22;q22) - одна из самых частых специфических аномалий кариотипа при ОНЛЛ. Она наблюдается в 20% случаев у взрослых и у 40% детей с М2-вариантом. При этой транслокации в результате слияния фрагментов двух генов - AML1 и ETO образуется химерный ген AML1-ETO. Химерный ген или его транскрипт может быть обнаружен с помощью ПЦР или FISH у всех больных с t(8;21). В отдельных случаях транслокация является скрытой: ее удается обнаружить не при стандартном цитогенетическом анализе, а только с помощью ПЦР или FISH (Krauter et al., 1998). Химерный транскрипт при транслокации t(8;21) обнаруживается у большинства больных даже в ходе длительной ремиссии (Nucifora et al, 1993; Kusek et al., 1994). Следовательно, качественная ПЦР не подходит для мониторинга МРБ у больных с t(8;21). Количественная ПЦР позволяет оценить эффективность лечения и предсказать гематологический рецидив, который обязательно следует за молекулярным рецидивом (Tobal et al., 1998). Недавно опубликованы работы, в которых приводятся данные о том, что исчезновение химерного транскрипта AML1-ETO в результате лечения предвещает длительную стойкую ремиссию (Morschauser et al, 2000).
Острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ, М3) тесно ассоциирован с хромосомной транслокацией t(15;17)(q22;q21), которая является важнейшим диагностическим маркером ОПЛ. В результате этой транслокации возникают химерные гены PML-RARa и RARa -РML. Химерные транскрипты PML-RARa и RARa -РML являются важными маркерами для молекулярного диагноза и мониторинга МРБ (Grimwade et al., 1997; Krauter et al., 1998). Hа огромном материале (сотни больных) было продемонстрировано, что исчезновение химерного транскрипта после консолидационных курсов лечения сопровождалось наступлением гематологической ремиссии. При сохранении транскрипта, несмотря на достижение полной гематологической ремиссии, последняя оказывалась короткой: наблюдались ранние рецидивы. В случаях, где после периода ПЦР-негативности (молекулярной ремиссии) химерный транскрипт обнаруживался вновь (молекулярный рецидив), практически всегда не позже, чем через полгода развивался гематологический рецидив (Diverio et al., 1998; Burnett et al, 1999). Опубликованы несколько успешных попыток предотвратить гематологический рецидив ОПЛ, начав лечение во время молекулярного рецидива (Grimwade et al., 1997; Diverio et al., 1998). Последняя из этих публикаций - весьма обнадеживающая: повторные молекулярные ремиссии были достигнуты у 12 из 14 пациентов в результате интенсификации терапии во время молекулярного рецидива.
В группу ОНЛЛ с благоприятным прогнозом включены также лейкозы с перицентрической инверсией хромосомы 16 - inv(16)(p13;q22) или транслокацией t(16;16)(p13;q22), в результате которых возникает химерный ген CBFb-MYH11 . Эти аномалии наблюдаются у всех больных с морфологическим вариантом ОМЛ-M4Eo, они обнаруживаются также в 40% случаев ОМЛ-М4. Среди всех случаев, где обнаружен химерный ген CBFb-MYH11, только половину составляют миеломоноцитарные лейкозы, в остальных случаях был поставлен диагноз М2, реже - М1 или М5. Химерный транскрипт слитного гена CBFb-MYH11 выявляется у всех больных с помощью ПЦР (Langabeer et al., 1997). Кинетика химерного транскрипта CBFb-MYH11 в ходе заболевания изучена хуже, чем других транскриптов у больных в группе ОНЛЛ с относительно благоприятным прогнозом. В большинстве случаев наступление полной молекулярной ремиссии существенно отстает от установления полной гематологической ремиссии. Химерный транскрипт может определяться вплоть до 24 месяцев от начала гематологической ремиссии. Рецидивы чаще наблюдаются у пациентов, у которых транскрипт обнаруживается в течение 6 месяцев и более от начала ремиссии (Martin et al, 2000). Появление химерного транскрипта после периода ПЦР-негативности в ходе ремиссии предвещает приближение гематологического рецидива (Laczika et al., 1998).
Наша исследовательская группа проводит молекулярный мониторинг 26 пациентов с прогностически благоприятными хромосомными аномалиями. Работа начата около двух лет назад. В 21 одном случае удалось провести от двух до шести ПЦР анализов. В этом сообщении мы остановимся только на данных о группе пациентов с транслокацией t(8;21) (10 случаев). У 6 из них так же, как и в большинстве опубликованных наблюдений, обнаружено сохранение химерного транскрипта на фоне полной ремиссии, длящейся от 3 до 24 месяцев. У 4 пациентов выявлена ПЦР-негативность: у 2 из 3 больных, обследованных в ходе длительной ремиссии (протокол mBFM-87), и у 2 из 4 - на ранних сроках от начала лечения по программе ОМЛ 2000. Вероятно, причиной раннего (в сроки до 6 месяцев от начала ремиссии) исчезновения транскрипта является уменьшение количества лейкозных клеток, обусловленное весьма агрессивной терапией. Дальнейшее наблюдение покажет, какое прогностическое значение имеет исчезновение транскрипта AML1-ETO у наших больных.
Сейчас мы делаем первые шаги по использованию одной из модификаций так называемой конкурентной РТ-ПЦР для определения уровня химерного транскрипта AML1-ETO в костном мозге и крови больных (количественный метод). Всего обследованы 6 человек. Подтверждены литературные данные о снижении уровня химерного транскрипта после первых терапевтических курсов (индукции и консолидации). У двух пациентов, обследованных несколько раз в ходе гематологической ремиссии, зафиксировано постепенное понижение уровня транскрипта. Наблюдение продолжается. Планируется интенсификация терапии при обнаружении молекулярного рецидива.
Приведенные данные демонстрируют необходимость продолжения цитогенетических исследований при ОНЛЛ с целью уточнения прогностического значения отдельных хромосомных аномалий, в частности, редких изменений кариотипа. Эти исследования невозможны без использования молекулярно-генетических методик. Большие надежды возлагаются на мониторинг МРБ как перспективный метод индивидуального прогнозирования.
Список литературы:
1. Baer MR, Stewart CC, Lawrence D et al. Blood 1997, 90: 1643-1648.
2. Burnett AK, Grimwade D, Solomon E et al. Blood, 1999, 93: 4131-4143.
3. Creutzig U, Zimmerman M, Kitter J et al. Br J Haematol. 1999,104: 630-639.
4. Diverio D, Rossi V, Avvisati G et al. Blood, 1998, 92: 784-789.
5. Grimwade D, Gorman P, Duprez E et al. Blood 1997, 90: 4876-4875.
6. Grimwade D, Walker H, Oliver F et al. Blood 1998, 92: 2322-2333.
7. Ferrara F, Morabito F, Martino B.J et al. Clin Oncol. 2000, 18: 1295-1300.
8. Heim S, Mitelman F. Cancer Cytogenetics. Second ed., Wiley-Liss, 1995.
9. Kern W, Schoch c, Haferlach T et al. Leukemia 2000, 14: 226-231.
10. Кrauter J, Paschberg B, Heinze B et al. Br J Haematol.1998, 103: 72.
11. Kusek R, Laczika K, Knobl P et al. Leukemia 1994, 8: 735-739.
12. Laczika K, Novak N, Hilgarth B et al. Clin Oncol. 1998, 16: 1519-1525.
13. Langabeer S, Walker H, Rogers HR et al. Brit J Haematol. 1997, 99: 925-928.
14. Lemez P, Galikova J, Haas T et al. Leuk Res 2000, 24: 207-15.
15. Martin G, Barragan E, Bolufer P et al. Haematologica 2000, 85: 699-703.
16. Morschhauser F, Cayela JM, Martini S et al. J Clin Oncol. 2000, 18(4): 788-94.
17. Mrozek K, Heinonen K, Lawrence D et al. Blood 1997, 90: 4532-38.
18. Nucifora G, Larson R, Rowley JD. Blood 1993, 82: 712-715.
19. Peniket AJ, Wainscoat JS, Wheatley K et al. Blood 1999; 94: 496a.
20. Radich JP. Curr Opin Oncol., 2000, 12: 36-40.
21. Schoch C, Haase D, Haferlach T et al. Leukemia 1996, 10: 1288-1295.
22. Slovak ML, Kopecky KJ, Cassileth PA et al. Blood, 2000, 96: 4075-83.
23. Shibuya N, Taki T, Mugishima H et al. Genes Chrom Cancer 2001, 32:1-10.
24. Swansbury GJ, Slater R, Bain BJ et al. Leukemia 1998, 12: 792-800.
25. Tamura S, Takemoto Y, Wada H et al., 1998 Brit J Haematol. 101: 743-748.
26. Tobal K, Liu Yin JA. Leuk Lymphoma, 1998, 1-2: 115-120.
27. Tobal K et al. Blood, 2000, 95: 815-819.
28. Visani G, Bernasconi P, Boni M et al. Leukemia 2001,15: 903-909.
