ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ПЕРЕДАЧИ МИТОГЕННЫХ СИГНАЛОВ ФАКТОРОВ РОСТА - ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ПРЕПАРАТОВ
Н.Е. Кушлинский
ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва
Известно, что в основе противоопухолевого эффекта большинства химиопрепаратов лежит подавление по тому или иному механизму процессов синтеза предшественников и репликации ДНК. Однако многие опухоли со временем приобретают устойчивость к большинству подобных препаратов, для преодоления которой необходим поиск новых мишеней и разработка новых подходов к лекарственному лечению резистентных новообразований.
В последнее время одним из перспективных направлений в этой области считается создание препаратов, воздействующих на процессы регуляции пролиферации и передачи митогенных сигналов в опухолевых клетках. Условно первым из выше указанных видов терапии можно считать эндокринное лечение вообще и использование антигормонов в частности. Однако перспективы эндокринной терапии ограничены, в основном, лечением гормонозависимых опухолей репродуктивной системы. Причем в данном случае речь идет о подавлении эффекта внешних регуляторных стимулов. В то же время характерной особенностью высоко злокачественных опухолей является утрата ими зависимости от внешних центральных регуляторов и, как следствие, автономный "самоподдерживающийся" рост, регулируемый локально продуцирующимися факторами.
К числу важных локальных (ауто- и паракринных) регуляторов пролиферации опухолевых клеток относятся так называемые факторы роста - пептиды и белки, продуцируемые опухолевой клеткой или окружающей ее стромой и взаимодействующие с соответствующим рецептором на мембране самой клетки-продуцента, либо на мембране соседней клетки. К настоящему времени уже известен не один десяток факторов роста, имеющих множественные изоформы и взаимодействующих с различными рецепторами, однако предметом нашего внимания является только одна группа небольших полипептидов с молекулярной массой около 6000 дальтон, взаимодействующих с общим мембранным рецептором, называемым по наиболее известному из своих лигандов рецептором эпидермального фактора роста (РЭФР).
Помимо собственно эпидермального фактора роста (ЭФР), специфическими лигандами РЭФР являются a-трансформирующий фактор роста (a-ТФР), фактор роста вируса коровьей оспы и некоторых других вирусов группы оспы, а также открытые относительно недавно пептиды - амфирегулин, cripto, бетацеллюлин, связывающий гепарин ЭФР-подобный фактор. Они имеют между собой 24-40% гомологии по первичной структуре, но сходны по пространственному строению благодаря наличию консервативных последовательностей в областях 3-х дисульфидных мостиков, определяющих и стабилизирующих конформацию молекул. Эти пептиды оказывают сходные биологические эффекты на чувствительные клетки, а также способны перекрестно индуцировать синтез друг друга. До недавнего времени ЭФР рассматривался как наиболее важный регулятор РЭФР-зависимого пути пролиферации в нормальных тканях взрослого организма, а a-ТФР - как регулятор эмбрионального развития, играющий также существенную роль при злокачественной трансформации клеток.
РЭФР, крупный трансмембранный гликопротеин с мол. массой 170000 дальтон, является продуктом одного из онкогенов семейства erb - c-erbB1, относится к числу рецепторных тирозинкиназ (РТК), важных регуляторов клеточной пролиферации и злокачественной трансформации, принципиальной особенностью которых является трансмембранная локализация и необходимость во взаимодействии с соответствующим полипептидным лигандом для реализации киназной активности.
Молекула РЭФР, как и молекулы всех рецепторных тирозинкиназ, состоит из 3-х основных доменов: внеклеточного N-концевого гликолизированного лиганд-связывающего участка, составляющего около 50% всей молекулы (621 из 1173 аминокислотных остатков) и обеспечивающего специфичность восприятия сигнала; собственно трансмембранного a-спирального участка, состоящего всего из 23 гидрофобных аминокислот, и внутриклеточного тирозинкиназного домена (542 аминокислоты), наиболее консервативного участка.
Благодаря исследованиям последних лет структура РЭФР описана весьма детально, и в каждом из главных доменов теперь также выделяются различные функционально важные участки. Так, в лиганд-связывающем домене выделяют 2 цистеин-богатых участка, стабилизирующих вторичную структуру домена, и 2 глобулярных, богатых глицином, фрагмента, которые и ответственны, по-видимому, за узнавание специфических лигандов. Непосредственно к трансмембранной спирали с внутриклеточной стороны примыкает небольшой, так называемый околомембранный регуляторный фрагмент, затем следуют собственно киназный, АТФ-связывающий участок, еще один "шарнирный" (hinge) регуляторный фрагмент и, наконец, аутофосфорилируемый С-концевой субдомен. В регуляторных фрагментах находятся остатки треонина и серина, которые могут фосфорилироваться внутриклеточными протеинкиназами, такими как протеинкиназа С (ПКС) или митоген-активируемая протеинкиназа (МАП киназа) или киназа МАП киназы.
Предполагается, что фосфорилирование Тре654 в околомембранном фрагменте под действием ПКС и, возможно, некоторых других протеинкиназ аллостерически регулирует сродство рецептора к лиганду и активность киназного домена, а фосфорилирование Тре669 и Сер671, а также нескольких сериновых остатков в "шарнирном" участке МАП киназой регулирует скорость ЭФР-зависимой интернализации рецептора. В С-концевом участке молекулы РЭФР находится по крайней мере 4 остатка тирозина (Тир1068, Тир1086, Тир1148 и Тир1173), которые аутофосфорилируются внутренней РТК. Именно эти фрагменты молекулы РЭФР распознаются эффекторными или адаптерными белками и обеспечивают передачу регуляторных сигналов и реализацию эффектов факторов роста.
Эксперименты по связыванию меченых лигандов с РЭФР свидетельствуют о том, что взаимодействие происходит в стехиометрическом соотношении 1:1, однако анализ методом Скэтчарда указывает на возможность существования в одной и той же клетке двух типов РЭФР с высоким (К d = (1-3)х10-10 М) и низким (К d = (2-15)х10-9 М) сродством к лигандам. Функциональное значение каждого из этих типов РЭФР пока четко не разграничено. После связывания лиганда происходит димеризация рецептора, активация внутренней тирозинкиназы, аутофосфорилирование и изменение конформации рецептора, способствующее связыванию и фосфорилированию экзогенных субстратов.
Оба основных функциональных участка молекулы РЭФР могут стать мишенью действия соответствующих блокаторов. Взаимодействие связывающего участка с лигандом может быть подавлено неспецифическими (типа сурамина) и специфическими (в первую очередь, моноклональными антителами к рецептору) агентами, а активность тирозинкиназы - различными ингибиторами, которых в настоящее время разработано уже много, и некоторые из которых достаточно специфичны для тирозинкиназы РЭФР. Установлено также, что моноклональные антитела к РЭФР подавляют рост опухолей только в том случае, если происходит торможение аутофосфорилирования РЭФР.
Связывающий участок РЭФР может быть мишенью и еще для одного класса противоопухолевых препаратов - гибридных белков, содержащих конъюгаты факторов роста и бактериальных токсинов или других цито-токсических агентов. В данном случае, РЭФР выступает уже в качестве направленного переносчика токсического агента в опухолевую клетку.
Известно, что некоторые мутации в молекуле РЭФР приводят к стабилизации его димерного состояния, постоянной активации тирозинкиназы в отсутствии лиганда или к ингибированию процесса интернализации рецепторов. Все они способствуют сохранению трансформированного фенотипа и делают клетку устойчивой к действию агентов, подавляющих связывание лиганда с рецептором. В опухолях с такими мутантными рецепторами, наряду с ингибиторами тирозинкиназы, важную роль приобретают и препараты, блокирующие последующие этапы реализации митогенных сигналов факторов роста.
Важнейшие внутриклеточные сигнальные системы, в регуляции которых участвует РЭФР, - это метаболизм фосфатидилинозитола и система гена ras, включающая целый каскад митоген-активируемых протеинкиназ.
Метаболизм фосфатидилинозитола (PI) - это один из первых процессов, для которых было доказано регуляторное действие ЭФР-рецепторной системы. Этот фосфолипид, составляющий относительно небольшую фракцию липидов клеточной мембраны, является тем не менее важным вторичным мессенджером и играет центральную роль во многих внутриклеточных сигнальных системах. Действие ЭФР на клетки, содержащие соответствующие рецепторы, вызывает быстрое увеличение скорости обмена фосфоинозитидов. Наиболее существенной частью сложного метаболизма фосфоинозитола (рис.2) является фосфорилирование и дефосфорилирование различных участков инозитольного кольца, а ключевой реакцией, в регуляции которой участвует активированный ЭФР-рецепторный комплекс, является превращение одного из промежуточных продуктов метаболизма PI - PI-4,5-бифосфата (PIР2) - под действием фосфолипазы С (ФЛС) в инозитол-1,4,5-трифосфат (IР3) и диацилглицерол (ДАГ). Каждое из этих веществ само по себе служит важным вторичным мессенджером: IР3 мобилизует свободный внутриклеточный Са2+, а ДАГ активирует протеинкиназу С - ключевой фермент регуляции пролиферации, транскрипции, промоции опухолей. ПКС в свою очередь активирует фосфолипазу D, стимулируя тем самым гидролиз другого важного фосфолипида - фосфатидилхолина.
Участие ЭФР в регуляции этих процессов осуществляется, по-видимому, в результате того, что активированный РЭФР связывает и затем фосфорилирует одну из форм ФЛС - ФЛСy-1, переводя ее в активное состояние. Активированный РЭФР связывает и, возможно, фосфорилирует также еще ряд ферментов метаболизма фосфоинозитола - киназы PI 3, PI 4 и PIР 5. При этом если роль двух последних ферментов достаточно очевидна и заключается в осуществлении последовательного превращения PI -> PIР -> PIР2 с образованием субстрата ФЛС, то значение активации PI 3, превращающей PI, PIР и PIР2 в соответствующие производные, содержащие фосфатную группу в положении D3 инозитольного кольца и не гидролизуемые ни одной из форм ФЛС, остается пока не вполне ясным. Исследования последних лет показали, однако, что активация PI 3 киназы, происходящая непосредственно под действием фосфорилированного РЭФР, является пусковым механизмом, обеспечивающим ras-независимую стимуляцию некоторых важных регуляторных киназ, таких как pp70 S6, Akt/Rac, а также ras-зависимую стимуляцию JNK-киназы.
Другой важнейшей системой, регулируемой с участием активированного РЭФР, является система гена ras. Продукт гена ras, белок р21ras, представляет собой регуляторный трансмембранный G белок (белок, связывающий гуаниновые нуклеотиды). Так же, как другие G белки, р21ras активен в ГТФ-связанном состоянии и неактивен в ГДФ-связанной форме. G белки участвуют в передаче внеклеточных регуляторных сигналов гормонов, факторов роста, нейромедиаторов к системе внутриклеточных вторичных мессенджеров. Непосредственной мишенью действия активированного р21ras является внутриклеточная серин-треониновая протеинкиназа raf (белок р74c-raf), гомологичная белкам семейства РКС. Raf-киназа, в свою очередь, активирует целый каскад внутриклеточных киназ МАП киназ и собственно МАП киназ. В результате этой активации происходит фосфорилирование протоонкогена с-jun, являющегося транскрипционным фактором, и индукция транскрипции онкогенов с-fos, c-myc и других генов, инициирующих митоз. Raf-киназа может также непосредственно фосфорилировать и, соответственно, активировать находящийся в цитоплазме неактивный c-myc, в результате чего он возвращается в ядро и связывается со специфическими участками хроматина, инициируя экспрессию с-fos, с-jun и с-ras.
Таким образом, можно более или менее детально представить процесс передачи регуляторного сигнала ЭФР (и др. лигандов РЭФР) от клеточной мембраны к ядру.
Дальнейшие исследования показали, что активированные РТК оказывают влияние на ras не непосредственно, а через сложную цепь адаптерных и эффекторных белков. С одной стороны, молекула rasGAP содержит аминокислотную последовательность SH2 (src homology 2) - белковый домен размером около 100 аминокислот, наличие которого, по-видимому, является отличительным признаком всех субстратов РТК, так как именно они узнают фосфорилированные последовательности активированных РТК (SH2 домены присутствуют, в частности, в структуре ФЛС*, PI 3 киназы и других субстратов РТК. Таким образом, rasGAP может непосредственно фосфорилироваться киназой РЭФР. С другой стороны, расшифрована цепочка молекул, передающих активирующий сигнал от РТК к факторам обмена нуклеотидов, в частности, к белку, получившему название SOS из-за своей гомологии с регуляторным белком дрозофилы "son of sevenless". Непосредственным переносчиком сигнала от фосфорилированного рецептора к SOS служит так называемый белок GRB2 (Growth Factor Receptor Bound 2), имеющий в своем составе как один узнаваемый РТК SH2 домен, так и два домена SH3 (src homology 3) - небольшие последовательности примерно из 50 аминокислот, способные узнавать богатые пролином участки в некоторых белковых молекулах. В передаче сигнала может участвовать также еще один небольшой белок (small connector protein - shc; 42 - 66 kDa), который содержит SH2, но не SH3 домен, фосфорилируется РЭФР и взаимодействует с GRB2.
По последним данным, путь РЭФР- shc - GRB2 - SOS более важен для активации ras, чем прямое взаимодействие РЭФР с GRB2. Показано также, что весь процесс активации ras происходит на клеточной мембране, куда транслоцируются соответствующие белки после аутофосфорилирования РЭФР, в результате чего регуляторный белок SOS оказывается в непосредственной близости от эффекторного белка р21ras. В связи с этим важную роль в процессе передачи митогенного сигнала ЭФР через систему ras играет реакция фарнезилирования белка р21ras - присоединения к его С-концевому участку специфического липидного фрагмента, обеспечивающего прикрепление этого белка к клеточной мембране. С-фарнезилирование, обеспечивающее прикрепление белка к мембране, важно также и для активации PI-3-киназы. В этой связи ингибиторы фарнезилирования считаются в настоящее время одним из перспективных новых классов противоопухолевых агентов.
Hsuan предложил теоретическую схему, согласно которой могут взаимодействовать между собой два главных пути передачи митогенных сигналов факторов роста (активация обмена фосфатидилинозитола и активация системы ras). Представленная им модель предполагает возможность образования на клеточной мембране вокруг активированной РТК (в частности, РЭФР) олигомолекулярного комплекса высокого порядка, включающего всю совокупность РТК-регулируемых киназ, адаптерных и эффекторных молекул и обеспечивающего передачу регуляторных сигналов и взаимодействие между различными внутриклеточными сигнальными системами. Некоторые теоретические предположения уже нашли свое подтверждение в экспериментальных исследованиях.
Описанная выше достаточно сложная схема механизма действия факторов роста, опосредуемого их специфическими рецепторами, является тем не менее достаточно упрощенной и не охватывает всех возможных эффектов активированных РТК, которые могут включать взаимодействие с белками цитоскелета, регуляцию активности протеинфосфатаз, а также прямое фосфорилирование транскрипционных факторов. Кроме того, эта схема предполагает наличие только мембранно-цитоплазматических эффектов, однако в последнее время появились исследования, свидетельствующие о том, что ЭФР-рецепторные комплексы могут также транслоцироваться в ядро клетки.
Блокирование любого из этапов передачи митогенного сигнала факторов роста может, в принципе, привести к нарушению регуляции пролиферации опухолевых клеток и, потенциально, к торможению роста опухоли. В эксперименте уже исследовано достаточно большое количество препаратов, влияющих на вышеперечисленные процессы: специфические и неспецифические блокаторы связывания РЭФР с лигандами, ингибиторы тирозинкиназы и МАП-киназ, блокаторы связывания SH2 доменов эффекторных белков с активированным рецептором, соединения, подавляющие активацию гена ras, в том числе, ингибиторы фарнезилирования, и др. Большинство из них находятся на стадии предклинического изучения, хотя ряд препаратов (в частности, моноклональные антитела к РЭФР) уже прошли I фазу клинических испытаний и показали себя достаточно эффективными при некоторых видах опухолей. Данные об основных классах препаратов, влияющих на РЭФР-зависимые процессы, суммированы в таблице, а результаты их экспериментального и клинического изучения подробно рассмотрены в наших обзорах. Показано также, что компоненты ЭФР-зависимой цепочки передачи митогенного сигнала могут стать мишенью действия и таких достаточно активно использующихся препаратов, как тамоксифен, аналогов люлиберина и аналогов соматостатина.
Еще одним из активно развивающихся в последнее время подходов к лечению злокачественных опухолей путем воздействия на процессы передачи митогенных сигналов является использование антисмысловых РНК (или олигонуклеотидов) к различным компонентам этой системы, которые будут подавлять биосинтез соответствующих белков. Сейчас уже сконструированы такие РНК для РЭФР, a-ТФР и некоторых других регуляторных молекул.
Существует несколько путей повышения эффективности разработки и использования подобных препаратов, а именно: изучение структурных особенностей молекул-мишеней для создания наиболее специфичных блокаторов, детальная расшифровка механизма передачи митогенного сигнала для выявления новых потенциальных мишеней, уточнение механизмов действия созданных препаратов в условиях in vitro и изучение их фармакодинамики и фармакокинетики у экспериментальных животных. Но кроме этого, для успешного и целенаправленного использования всех вышеперечисленных препаратов в клинике необходимо не только углубленное предклиническое изучение их эффективности, но и выявление спектра потенциально наиболее чувствительных опухолей, основанное на исследовании соотношения экспрессии РЭФР и их лигандов с активностью и экспрессией ЭФР- регулируемых ферментов и процессов в опухолях человека. Для оценки возможности избирательного действия препарата на опухолевые клетки важно также сравнительное изучение экспрессии белков-мишеней или активности ингибируемых процессов в опухоли и в окружающей ее гистологически неизмененной ткани.
В лаборатории клинической биохимии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России уже несколько лет проводится исследование содержания рецепторов эпидермального фактора роста и их лигандов в различных опухолях человека - функциональной активности РЭФР по критерию влияния ЭФР на скорость обмена фосфолипидов в изолированных опухолевых клетках in vitro. В этих исследованиях мы используем радиолигандные, радиоиммунологические и радиорецепторные методы. Одной из задач этого скрининга является выявление спектра опухолей, потенциально чувствительных к препаратам, блокирующим различные этапы ЭФР-зависимой стимуляции пролиферации.
В настоящее время уже исследовано более 500 образцов опухолей различных локализаций у взрослых больных и у детей: это опухоли женской репродуктивной системы, опухоли костей, рак легкого, рак пищевода у взрослых; некоторые наиболее часто встречающиеся солидные опухоли детей. Самый большой материал нами собран при раке молочной железы (291 опухоль), однако чаще всего РЭФР выявлялись при раке легкого и злокачественных опухолях костей. Как правило, частота выявления лигандов (ЭФР-подобных пептидов) такая же или даже больше, чем частота выявления рецепторов, что позволило нам высказать предположение о том, что именно наличие РЭФР является лимитирующим фактором при определении чувствительности опухоли к данному типу ауто/паракринной регуляции.
Для каждой локализации опухоли проводится детальный анализ взаимосвязи экспрессии РЭФР и их лигандов с основными клинико-морфологическими факторами прогноза, а также ретроспективный анализ влияния их экспрессии на безрецидивную и общую выживаемость больных. Недавно завершен ретроспективный анализ влияния экспрессии РЭФР на 5-летнюю безрецидивную и общую выживаемость больных ранними стадиями рака молочной железы. Сравнение кривых безрецидивной выживаемости больных без метастазов в лимфатических узлах с условно "эндокринным" рецепторным фенотипом опухоли (РЭФР*РЭ+РП+) и больных с условно "ауто/паракринным" фенотипом (РЭФР+РЭ*РП*) выявило значительное и достоверное увеличение выживаемости в первой группе по сравнению со второй. Эта разница была наиболее выражена в ранние сроки после операции, сглаживалась при более длительном наблюдении и полностью исчезала к 5-му году после операции.
Результаты многофакторного регрессионного анализа безрецидивной выживаемости больных, получавших адъювантную гормоно- или химиогормонотерапию, свидетельствуют о том, что риск рецидивирования и/или метастазирования в наибольшей степени увеличивается при наличии в опухоли РЭФР, а влияние экспрессии РЭ и РП на риск возврата заболевания значительно меньше. Наилучшая безрецидивная выживаемость ожидается у больных с РЭФР*РЭ+ опухолями, а наихудшая - у больных с РЭФР+РЭ* опухолями. В то же время, безрецидивная выживаемость двух других групп больных определяется скорее статусом РЭФР, чем статусом РЭ: безрецидивная выживаемость больных с РЭФР*РЭ* опухолями лучше, чем у больных с РЭФР+РЭ+ опухолями.
Таким образом, больные с РЭФР+РЭ*РП* опухолями даже на ранних стадиях заболевания относятся к группе повышенного риска рецидивирования и/или метастазирования, они относительно устойчивы к эндокринной терапии, но вполне могут оказаться чувствительными к препаратам, влияющим на РЭФР-зависимые процессы.
Интересные закономерности выявлены нами для больных остеосаркомой: при содержании РЭФР в опухоли от 10 до 150 фмоль/мг белка мембран безрецидивная выживаемость больных остеосаркомой оказалась достоверно меньшей, чем при содержании РЭФР более 150 или менее 10 фмоль/мг белка. Можно предположить, что при этом злокачественном новообразовании существует лишь определенный диапазон концентраций РЭФР, при котором их экспрессия оказывает неблагоприятное влияние на прогноз заболевания, и, по-видимому, именно при таких уровнях экспрессии рецепторов в опухоли использование РЭФР-блокирующих препаратов может оказаться наиболее эффективным.
При немелкоклеточном раке легкого значимым для предсказания прогноза заболевания и для выбора группы больных, потенциально чувствительных к анти-РЭФР-направленным препаратам, оказалось одновременное исследование РЭФР и ЭФР-подобных пептидов: к прогностически неблагоприятной группе были отнесены больные, опухоли которых одновременно экспрессировали и рецепторы, и их лиганды.
Таким образом, приведенные выше примеры свидетельствуют о том, что набор показателей и количественные критерии, используемые для оценки потенциальной чувствительности опухолей к препаратам, влияющим на РЭФР-зависимые процессы, могут существенно отличаться для больных опухолями различных локализаций, поэтому необходимо проводить специальные исследования при каждой из нозологий.
В последнее время продолжаем исследования по новой схеме - в опухолях молочной железы и гомологичной гистологически неизмененной ткани изучаем два ключевых фермента, участвующих в реализации эффектов активированных РЭФР - МАП-киназу р42/р44, так называемую ERK - конечное звено каскада киназ, осуществляющего передачу сигнала активированного ras к ядерным структурам, - и фосфатидилинозитол-3-киназу, один из компонентов фосфолипидного цикла, непосредственно фосфорилируемый и активируемый тирозинкиназой РЭФР и запускающий активацию еще одного каскада протеинкиназ. Активность МАП-киназы определяем радиоизотопным методом по фосфорилированию специфического субстрата с последующим его осаждением на фильтрах. Кроме того, проводится определение количества иммунореактивного белка PI-3-киназы и МАП-киназы методом Western blot анализа. Все эти исследования находятся на начальном этапе, однако есть некоторые интересные предварительные данные. В частности, удалось показать, что количество иммунореактивного белка PI-3-киназы в опухолях значительно выше, чем в окружающей ткани молочной железы, что является обнадеживающим в плане избирательности действия соответствующих ингибиторов на опухолевую ткань.
Полагаем, что характеристика соотношения и активности различных компонентов сигнальной цепочки, активируемой под действием ауто/паракринных факторов роста, в опухолях человека должно обязательно проводиться параллельно с разработкой новых препаратов, воздействующих на эту систему регуляции, для того чтобы их клинические испытания и возможное применение были максимально эффективными.
